Mouse  IL-6 ELISA試劑盒原理說明

IL-6 簡介： 白細胞介素 6（IL-6）是一種多功能蛋白，在宿主防御、急性期反應、免疫反應和造血中發(fā)揮重要作用。IL-6 由各種正常和轉化的細胞表達，包括 T 細胞、B 細胞、單核細胞/巨噬細胞、成纖維細胞、肝細胞、角質細胞、 星形細胞、血管內皮細胞和各種腫瘤細胞。IL-6 的產生被許多信號上調，包括有絲分裂或抗原刺激、LPS、鈣 離子團、IL-1、IL-2、IFN、TNF、PDGF 和病毒。IL-6 在單核細胞中的表達受到 IL-4 和 IL-13 的抑制。

實驗原理： 本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被有小鼠白細胞介素 6（IL-6）捕獲抗體的 微孔中，依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢測抗體，HRP 酶結合物，中間經過溫育和洗滌，用底物 TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中 的小鼠白細胞介素 6（IL-6）呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

試劑盒參數： 需自備的設備及試劑： 1. 450±10nm 濾光片酶標儀 2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL. 3. Eppendorf 移液器. 4. 蒸餾水或去離子水. 5. 脫脂棉吸水紙. 6. 37℃恒溫箱. 8. 準備若干個標準品稀釋管. 

樣本處理及要求：

1. 試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關文獻預估樣本中待測物的濃度并 通過預實驗確定樣本的實際濃度情況。如果樣品中待測物濃度過高或過低，請對樣本做適當的稀釋或濃縮。 

2. 若所檢樣本不在說明書所列樣本之中，建議做預實驗驗證其檢測有效性。 

3. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時或 4℃過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清 即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

4. 血漿：用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的 30 分鐘內于 2-8℃1000×g 離心 15 分鐘， 取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

5. 組織勻漿：用預冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結 果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的 PBS（一般按 1:9 的重量體積比，比如 1g 的組織樣 品對應 9mL 的 PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑） 加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍 融。最后將勻漿液于 5000×g 離心 5~10 分鐘，取上清檢測。 

6. 細胞培養(yǎng)物上清：請 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免 反復凍融。

7. 其它生物標本：1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測。

8. 樣品外觀：樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。 

9. 樣品保存：樣品收集后若在 1 周內進行檢測的可保存于 4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍 存于-20℃（1 個月內檢測），或-80℃（6 個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果， 因此溶血標本不宜進行此項檢測。 性能 靈敏度 2.63pg/mL 檢測范圍 7.81-500pg/mL 特異性 可檢測樣本中小鼠的 IL-6，且與其類似物無明顯交叉反應.

操作步驟： 1. 從室溫平衡 10 分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。 

2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標準品按照 100μl 每孔加入相應孔中，空白孔加入 100μL 通用稀釋液。蓋 上封板膜后 37℃溫育 1 小時。（建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋 1 倍后再加入酶標板內測試。從 而減少基質效應對測試結果的誤差影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋倍數。所有的待測樣本和 標準品在檢測中建議設立復孔）。

3. 加生物素化抗體：取出酶標板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液 100μL，蓋上封 板膜后 37℃溫育 1 小時。

4. 洗板：棄去液體，每孔加入 300μL 1x 洗滌液，靜置 1 分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板 3 次（也可用洗板機洗板）。

5. 加酶結合物工作液：每孔加入酶結合物工作液 100μL，蓋上封板膜后 37℃溫育 30 分鐘。

6. 洗板：棄去液體按步驟 4 洗滌方法，洗板 5 次。 

7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育 15 分鐘。 

8. 加終止液：取出酶標板，每孔直接加入終止液 50μL，立即在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。

結果判斷：

1. 計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。

典型數據和參考曲線：

以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。

試劑盒性能：

1. 重復性：板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。

2. 回收率：在選取的健康小鼠血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入3個不同濃度水平的小鼠IL-6，計算回收率

3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康小鼠血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠IL-6，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。